Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah
(Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk)

Oleh: Wendry Setiyadi Putranto,SPt.,MSi.

Disampaikan pada: Seminar Nasional Bioteknologi " Capturing Opportunities through Biotechnology" Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI 15-16 November 2006

Purifikasi dan Karakterisasi Protease Yang Dihasilkan Lactobacillus acidophilus dalam Fermentasi Susu Sapi Perah
(Purification and Characterization of Protease Lactobacillus acidophilus in Fermented Milk) Wendry Setiyadi Putranto Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran, Bandung

ABSTRAK Enzim protease dengan aktivitas proteolitik yang rendah telah dimurnikan dengan kromatografi yang konvensional dari Lactobacillus acidophilus. Enzim tersebut memiliki aktivitas optimum pada pH 5,5 pada suhu 370C. Pemurnian enzim dengan pengendapan amonium sulfat 45% dan kromatographi kolom dengan Sephadex G-100. Aktivitas protease dihambat oleh pengkelat logam dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). Berat molekul diukur dengan sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis adalah 72 kD. Kata kunci : aktivitas proteolitik, pemurnian,

ABSTRACT A proteolytic with low activation was purified by conventional chromatographic techniques from Lactobacillus acidophilus. The pH optimum of the enzymes was 5,5 at 370C. The enzymes was purified using 45% ammonium sulfate precipitation and column chromatography using Sephadex G-100. The protease activity was inhibited by chelating agent at the concentrations as follows: 1 mM and 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA). The molecular weight value as determined by sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis was 72 kD. Key words : proteolytic activation, purification

Pendahuluan Protease merupakan enzim yang sangat penting dalam industri pangan maupun non pangan. Pemanfaatan protease dalam industri pangan diantaranya adalah untuk mengurangi kekeruhan dalam industri bir, mengurangi gluten pada industri roti, dan untuk menggumpalkan susu pada industri keju. Enzim protease dapat diperoleh dari jaringan tanaman, hewan, maupun mikroba. Keterbatasan kemampuan hewan dan tumbuhan dalam memenuhi permintaan protease, telah mendorong berkembangnya protease mikroba. Mikroba memiliki peran penting sebagai penghasil protease karena memiliki beberapa keunggulan antara lain, mikroba memiliki siklus hidup yang singkat, efisiensi waktu dan tempat, produktivitas tinggi dan memudahkan kita untuk melakukan manipulasi genetik (melalui rekayasa genetika mikroba) maupun manipulasi dalam proses fermentasi (rekayasa bioproses). Mikroba yang telah dikembangkan secara komersial sebagai penghasil protease antara lain Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus pumilus, Aspergillus oryzae, dan Aspergillus niger. Lactobacilus acidopillus merupakan kelompok bakteri asam laktat (BAL) "friendly bacteria" yang merupakan kelompok bakteri yang banyak dimanfaatkan dalam industri fermentasi susu, baik dalam pembuatan yoghurt maupun keju. Bakteri tersebut mempunyai kemampuan menghidrolisis kasein yang ada pada susu dengan mengekskresikan enzim proteolitik. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mengetahui karakter biokimia protease intra seluler dari beberapa bakteri asam laktat seperti Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus, sedangkan karakter biokimia protease intra seluler maupun ekstraseluler dari Lactobacilus acidopillus belum banyak dilakukan terutama untuk isolat yang berasal dari Indonesia. Berdasarkan uraian diatas, peneliti merasa tertarik untuk mengkaji lebih jauh tentang karakter biokimia dari protease ekstraseluler dari acidopillus PAGE. secara kuantitatif maupun kualitatif Lactobacilus menggunakan metoda SDS

Metode Penelitian Strain Bakteri Asam Laktat yang digunakan adalah Lactobacilus acidopillus, media propagasi menggunakan MRS broth, sedangkan media produksi menggunakan susu sapi perah. Lactobacilus acidopillus dari media padat diinokulasikan pada media propagasi MRS broth (10 ml) inkubasi 37 0C,

dilakukan pengamatan pertumbuhannya pada dengan spektrofotometer (600 nm) Selanjutnya sebanyak 2% (v/v) diinokulasikan pada media susu sapi perah (UHT). Pengambilan sampel dilakukan tiap jam terhadap kedua media produksi tersebut, dilakukan pengamatan pertumbuhan mikrobanya, dan pengukuran aktivitas protease (Walter,1984) serta kadar protein (Bradford,1978). Pengukuran densitas bakteri pada media produksi susu sapi perah. Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan 9 ml EDTA (2g/l,pH 12) selanjutnya dilihat absorbansinya pada 600 nm ( Metoda Kanasaki ) Isolasi protease intra seluler Lactobacilus acidopillus Sampel disentrifugasi 12000 g, pada suhu 40C, selama 15 menit. Supernatan yang didapat merupakan enzim protease kasar selanjutnya dianalisis kadar protein dan aktivitas proteplitiknya. Isolasi protease ekstraseluler Lactobacilus acidopillus Crude extract ektraseluler protease diperoleh dengan memisahkan media (susu sapi perah) dengan sel bakteri, dialkukan sentrifugasi 12000 g, supernatant yang diperoleh dilakukan pengukuran aktivitas protease (Walter,1984) serta kadar protein (Bradford,1978). Pengendapan dengan Amonium sulfat Untuk menggumpalkan protein, supernatan hasil sentrifugasi ditambahkan ammonium sulfat sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan magnetic stirrer dengan konsentrasi (30%, 40%, 45%, 60%) dan dibiarkan selama satu malam

pada suhu 40C. Selanjutnya disentrifugasi 10000 rpm, suhu 4 0C, selama 15 menit. Pelet yang diperoleh diresuspensikan dengan buffer Tris-HCl 10 mM pH 8, kemudian dilakukan pengujian aktivitas proteasenya dengan metode Walter (1984) dan penentuan kadar proteinnya dengan metode Bradford (1976). Dialisis Dialisis dilakukan untuk menghilangkan kadar garam yang tersisa dari proses pengendapan dengan ammonium sulfat menggunakan kantong dialisis. Kantong diikat dengan benang jahit, lalu dimasukkan 10 ml larutan enzim, dan kemudian ujung lain diikat dengan benang. Kantung dimasukkan dalam larutan Tris HCl 20 mM dengan volume 100 kali volume filtrat dan diagitasi secara perlahan pada suhu 40C selama 1 jam. Setelah 30 menit bufer diganti dengan bufer segar. Enzim hasil dialisis dipekatkan menjadi setengah volume dengan freeze dryer dan disimpan pada suhu 40C untuk segera dilakukan kromatografi filtrasi gel. Kromatografi Filtrasi Gel Kolom kromatografi filtrasi gel Sephadex G-100 diekuilibrasi dengan mengalirkan bufer Tris HCL 10 M sebanyak 200 ml dan didiamkan selama semalam pada suhu 4 0C. Larutan protease sebanyak 2 ml dimasukkan dengan pipet secara perlahan kedalam kolom tepat di atas permukaan gel. Enzim dibiarkan mengalir perlahan sampai seluruh enzim berada dibawah permukaan gel. Kolom diisi dengan pengelusi yaitu bufer Tris HCl 10 mM pH 8. Fraksinasi sebanyak 20 fraksi sebanyak 70 tetes pada masing-masing fraksi menggunakan fraction collector. Setiap fraksi diukur aktivitas protease dan kadar proteinnya. Pengukuran konsentrasi protein (Bradford, 1976) Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine Serum Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Sebanyak 100 l sampel ditambah 5 ml pereaksi Bradford, selanjutnya dihomogenkan dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 370C dan kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 595 nm. Pengukuran Aktivitas Protease (Walter,1984)